杏彩体育:科学家使用光纤记录与单光子钙成像技术评估孤独症动物模型

　　光纤记录系统是一种基于光学原理的技术，该系统的工作原理是由LED光源发射出470nm波段的蓝色激发光，经二相色镜反射，被物镜耦合到一根多模光纤中，光纤末端将激发光传输到被试动物脑区，激发被GCaMP钙敏感荧光蛋白或其他敏感荧光探针所标记的神经元。神经元中的荧光蛋白强度受到钙离子浓度或者其他神经递质的调控，其荧光变化经过同一根光纤传回到探测光路，以图像的形式被CMOS采集后被软件提取转化为电压信号，进行显示和记录。研究者已将光纤记录系统广泛使用到纹状体、黑质、海马等脑区的科学研究中，加强了孤独症、抑郁症、癫痫等疾病中不同脑区的功能性研究。

　　钙离子成像技术是一项可以观察清醒动物神经元活动的技术，它通过结合Cre-LoxP技术改造的转基因动物和含有GCaMP基因片段的Cre依赖腺相关病毒的使用，可以实现在特定类型的神经元中特异性表达GCaMP钙敏感荧光蛋白，从而达到利用光学成像方法在脑功能研究中针对特异类型神经元成像的目的。为了对某一特定神经元活动进行检测，可使用特定类型神经元的启动子对全脑某神经元进行标记，如Ef1α为广谱启动子，hSyn为成熟神经元特异型启动子，GFAP为星形胶质细胞特异型启动子，CaMKIIa为兴奋性神经元特异型启动子等。但是，由于许多神经元或者胶质细胞没有成熟的启动子，如GABA能中间神经元、少突胶质细胞等，作者便可以使用Cre-LoxP基因重组技术改造的转基因动物，结合Cre依赖的病毒载体对特定类型的神经元进行特异性标记。由于重组腺病毒安全性高、表达稳定且有12种血清型可对不同组织结构具有不同的感染效率。

　　因此，可利用腺相关病毒感染的特性，将钙敏感荧光蛋白基因转染到特定类型的神经细胞中。由于不同的Cre品系动物可以使特定细胞表达Cre重组酶，通过脑立体定位注射技术将含有GCaMP基因片段的腺相关病毒注入特定脑区，可使Cre阳性细胞表达GCaMP钙敏感荧光蛋白，这种策略称为Cre-DIO策略。脑科学研究中已大量应用Cre-DIO策略进行特异神经元活动的监测，用以反映神经核团在特定行为发生时的功能。检测伏隔核多巴胺D1受体表达的神经元在觉醒调控中的钙信号活动变化，发现NAc-D1R神经元的活动性参与维持和产生觉醒活动；应用该技术观测到当奖赏出现时，中缝背核前脑5-羟色胺能神经元被激活，并且5-HT神经元与γ-氨基丁酸神经元的活性与奖赏过程中行为状态有关，但两者的活性不同；发现小鼠产生防御行为时，下丘脑室旁核的促肾上腺皮质激素释放激素阳性神经元的活性变化参与逃跑行为的产生，通过压力训练改变该神经元的活性会改变小鼠的防御策略；利用该技术检测小鼠黑质网状部GABA能神经元的钙信号，发现在癫痫发作期间该神经元被激活，并且其活性与癫痫发作程度呈正相关。

　　钙离子成像技术结合Cre-LoxP技术达到了对特定脑区的特异神经元活动变化进行实时检测的目的，可验证某神经元、神经环路活动与行为之间的关系，对理解众多以行为障碍为核心表现的神经精神疾病背后的脑机制至关重要。

　　利用D1-Cre和D2-Cre转基因工具鼠，在孕期第12.5天注射VPA的方法，构建ASD模型小鼠。随后借助脑立体定位技术将Cre重组酶依赖的钙敏感荧光探针分别注射至5周龄的对照组和模型组小鼠的DMS脑区，待手术恢复2周后，使用光纤记录系统记录DMS脑区的D1-MSNs和D2-MSNs在安静状态下的基础活动，并且记录社会互作行为和刻板重复行为发生时两类神经元的钙活动变化，探索DMS脑区两类神经元的活动性变化与ASD样行为表征之间的关系。

　　选取处于生育年龄的C57BL/6J为背景的D1-Cre和D2-Cre雌鼠各20只，C57BL/6J雄鼠20只，适应一周后，将雌雄鼠以2:1的比例于18:00合笼，次日7:00检查雌鼠口是否有阴栓。

　　把孕鼠随机分为对照组和模型组，每组10只，把检测到阴栓日定为第0.5天，于怀孕12.5天时，模型组孕鼠腹腔单次注射500mg/kg的丙戊酸；对照组孕鼠腹腔单次注射等体积0.9%的生理盐水。

　　把随机分组的孕鼠所生产的子代小鼠进行PCR鉴定，将基因鉴定结果为阳性的雄性个体分别作为后续实验所用的对照组和模型组小鼠，每组14只。当所有鼠年龄为30-35天时，进行行为学实验，测试在每日8:00~18:00进行。所有行为测试前一周每天用针织手套抚摸每只实验小鼠，使其熟悉拿取操作直至不产生应激行为为止，并且实验前两天应将实验动物放入行为房中进行饲养，避免由于环境差异对实验鼠的行为产生影响。测试进行时环境光照维持在40lux，实验人员避免出现在小鼠视线℃左右。每只小鼠测试完毕后用卫生纸擦拭干净小鼠粪便以及尿液，并用70%酒精除去行为箱中残留的气味。

　　旷场实验使用一个30cm×30cm×30cm敞口的行为箱检测小鼠自发活动行为，实验前调整摄像头与箱体位置确保准确采集动物行为。调试自动采集系统将旷场等分为16个区域，将核心4个区域定义为中心区域，其他区域定义为外周区域。实验时，将小鼠背朝实验人员放入行为箱体的中心区域，允许小鼠自由活动10min后，记录并分析10min内小鼠自发行为。

　　埋珠实验可用来测试小鼠的重复性挖掘行为，实验时将干净无味的木屑垫料放入小鼠饲养笼内，铺入深度约5cm，压平垫料后，加入标准黑色玻璃弹珠，按照3排，每排4颗弹珠等间距放置于垫料上。打开录像设备，将待测鼠头部向下轻放入实验笼的中心位置，记录20min内小鼠的行为。统计小鼠埋入的至少2/3弹珠体积的弹珠个数。每次实验开始前更换新鼠笼和垫料，使用洗涤剂彻底清洗玻璃弹珠，用蒸馏水冲洗去除异味并且擦拭干净。

　　居住者-入侵者实验使用常规的小鼠饲养笼即可对小鼠的社交能力进行评估。实验分为两个阶段：（1）将待测鼠的同窝鼠取出，保持实验鼠3h的社交隔离，期间小鼠可自由活动并能获取水和食物。（2）保持实验鼠笼内环境不变，打开录像设备，将体型和鼠龄略小于被试鼠的陌生鼠放入测试笼内，记录10min内实验鼠的跟随、嗅闻、攻击、逃离等社交行为表现。

　　糖水实验进行前，需对实验鼠进行3天的适应性训练：将小鼠放入糖水装置箱内，自由获取清水，以便熟悉测试环境和装置。完成适应性活动后，放回原饲养笼内。正式实验前一天于20：00开始剥夺饮水12h，次日早8：00进行测试，实验前把糖水装置内清水更换为5%白砂糖溶液，采集小鼠自发喝糖水时的钙荧光信号。

　　调节脑立体定位仪使小鼠头部前后、左右保持水平位置，差异小于0.03mm。随后在体式显微镜下将连接有玻璃电极的微量注射针定位到DMS脑区坐标位点：AP：0.7，ML：-1.5，前囟前后，中缝左右，使用颅骨钻进行打孔，钻孔大小刚好能够插入拉制后的玻璃电极，用洗耳球将骨屑吹开后再用针挑去颅骨和硬脑膜，再把棉球浸润生理盐水擦拭颅骨表面待用。使用微量进样泵以350nL/min的速度吸取350nL体积的钙荧光探针或者对照病毒以40nL/min注射200nL体积病毒至DMS脑区坐标位点：AP：0.7，ML：-1.5，DV：-2.8，颅骨平面向下，注射完成后停针10min使病毒扩散至组织内。将直径为200μm、数值孔径为0.37的光纤陶瓷插芯固定在夹持器上，埋置DMS脑区坐标处，并将小鼠头骨其余暴露位置进行覆盖。将小鼠取下，放在25℃左右的电热毯上，待小鼠苏醒后放入饲养笼中。病毒在脑内表达2周后开始记录小鼠DMS脑区中D1-MSNs与D2-MSNs神经元钙信号变化。

　　将光纤记录系统采集的钙荧光信号导入Matlab，提取6s的荧光信号。根据小鼠的行为，将记录的荧光信号数据划分成为不同的小段，并把舔舐糖水、掩埋大理石珠以及社交动作等行为开始发生点作为事件零点。利用Matlab中的Average模块，设定分析的事件，并将相对于事件行为前1.5s或者1s的时间窗内的钙离子荧光信号均值作为基线，用行为发生的荧光强度V signal与基线差值再除以基线与偏移值V offset的差值，即ΔF/F0=/F0-V offset的值来表示事件发生时钙离子荧光强度的变化。结果用热度图和事件相关钙信号趋势图来表示。热度图的蓝色表示荧光强度变化较小，红色表示荧光强度变化幅度大；线性相关的趋势图是将分析的所有事件进行平均所得到的荧光信号值。

　　（A）钙成像系统装置图；（B）Cre小鼠DMS脑区注射AAV-DIO-GCaMP6m病毒以及埋置陶瓷插芯的位置示意图；（C）钙成像实验流程

　　（A）和（C）表达GCaMP病毒（上）与对照病毒GFP（下）的D1-Cre小鼠（A）或者D2-Cre小鼠（C）舔舐糖水时钙信号反应原始轨迹图及打标示意图，红色代表舔糖水行为事件，黑色代表钙信号反应；（B）和（D）表达GCaMP病毒的D1-Cre小鼠和D2-Cre小鼠舔舐糖水时，DMS的D1-MSNs（B）和D2-MSNs（D）的事件相关曲线

　　6.李金. 孤独症模型小鼠背内侧纹状体神经元钙信号及相关受体表达变化研究[D].陕西师范大学,2022.

　　本文为澎湃号作者或机构在澎湃新闻上传并发布，仅代表该作者或机构观点，不代表澎湃新闻的观点或立场，澎湃新闻仅提供信息发布平台。申请澎湃号请用电脑访问。